수생동물 게놈 기반 다차원 오믹스 적용 수생태계 건강성 평가
프로토콜 파이프라인
01
모델생물 유전정보 구축
HMW DNA/RNA
Whole genome
sequencing
gDNA
RNA
Genome resource
02
현장 샘플 다차원 오믹스 통합 분석
Field sampling
Bulk RNA-Seq
Global
proteomics
Untargeted
metabolomics
RNA
Protein
Metabolite
Multi-omics integration
03
건강성 평가 바이오마커 발굴 & 건강성 지수 예측 모델 구축
Biomarker discovery
Health index prediction model construction
무척추동물 모델
새뱅이
Neocaridina denticulata어류 모델
피라미
Zacco platypus유전체 활용 유전정보 DB 구축
(1)
단일 개체에서 High molecular weight(HMW) gDNA 추출
(2)
Genome size estimation(NGS)
(3)
Genome assembly(TGS)
(4)
Chromosome level로 assembly(Hi-C)
(5)
다양한 기관(organ)에서 RNA 추출
(6)
RNA-Seq + ISO-Seq으로 전사체 확보
(7)
(1)~(4)에서 얻은 유전체에 정렬하여 유전자 예측
(8)
NCBI, KEGG 등 데이터베이스를 통해 functional annotation
전사체 활용 유전정보 DB 구축
* 개체 크기에 비해 유전체가 클 경우 TGS를 통한 충분한 coverage와 depth의 read를 생산하기 어려움
→ 1)에서 ⑤~⑧을 통해 대신 유전정보를 얻을 수 있음
Field sampling
새뱅이
Neocaridina denticulata(1)
두흉부 집게로 잡고 휴지로 물기와 이물질 제거
(2)
항문 쪽 자른 후 꼬리 부분 잡아당겨 장 제거
(3)
몸체 3등분하여 각각 다른 tube에 옮겨 담고 최소 10개체 이상 pooling
* 단, 분석 결과가 편향되지 않도록 각 tube 내에 머리, 몸통, 꼬리 적절히 섞음
피라미
Zacco platypus(1)
동물윤리에 의거하여 인도적인 방법으로 안락사
(2)
항문 쪽 피라미 간은 장을 따라 길게 분포해 있음. 간만 분리
* 쓸개, 비장, 백색지방이 같이 붙어있으므로 제거해야함
자른 후 꼬리 부분 잡아당겨 장 제거
(3)
분리한 간은 3등분하여 각각 다른 tube에 옮겨 담고 최소 3개체 이상 pooling
* 단, 분석 결과가 편향되지 않도록 각 tube 내에 머리, 몸통, 꼬리 적절히 섞음
→ 분석 전까지 -80℃ 이하에서 보관
Bulk RNA-Seq
Global proteomics
Untargeted metabolomics
RNA
Protein
Metabolite
TMT-labeling / DIA
NGS
HPLC +Mass spectrometry
Genome-based mapping
Functional annotation
Expression profiling
DEG / DET
DEP
DEM
Multi-omics integration
(1)
Normalized count를 행 병합하고 주성분분석과 계층 하이라키컬 클러스터링 분석을 통해 건강성지수 별, 오믹스 별 분포 차이 시각화
(2)
Log2fold-change(lfc)로 상대정량 후 통계적으로 유의한 차이를 보이는 값으로만 필터링
* 주로 |lfc| ≥ 1, adjusted P < 0.05로 cut-off
(3)
행 병합 후 KEGG pathway 또는 GO enrichment 분석
(4)
Network 분석을 통해 유전자-유전자, 유전자-대사물 간 상호작용 분석
건강성 지수와 상관관계가 높은 바이오마커 발굴
(1)
오믹스 데이터와 건강성 지수 상관관계 분석(Spearman)
(2)
예측 모델 훈련 및 검증(Random Forest-regression)
(3)
바이오마커 선정(Spearman & Random Forest 교집합)
바이오마커 훈련을 통한 건강성 지수 예측 모델 구축
(1)
예측 모델 재훈련 및 검증(Random Forest-regression)