가. eDNA 추출

본 단계는 환경 시료 내에 미량으로 존재하는 eDNA를 손실 없이 효율적으로 추출하는 것을 목적으로 한다.

• (1)

  시료통(50mL 코니컬 튜브)에 담긴 부착시료를 분리하기 위해 원심분리(3000rpm, 5min)하여 2mL를 남기고 상층액을 버린다.

• (2)

  부착 시료가 섞인 혼합액 2mL를 마이크로피펫을 이용하여 2mL 튜브에 옮긴 후 원심분리(8000rpm, 5min)한 뒤 부착시료 펠렛을 제외한 용액을 제거한다.

• (3)

  부착 시료가 포함된 2mL 튜브에 DNA 추출 시약 (100 mM Tris-HCl, 100 mM Na2-EDTA, 100 mM sodium phosphate, 1.5 M NaCl, and 1% cetyltrimethylammonium bromide) 800 μL를 넣어, 이후 분석 전까지 -20 °C에서 보관한다.

• (4)

  부착시료가 포함된 2 mL 튜브에 Proteinase K (25mg/mL)를 8 μL 첨가한 후, shaking incubator에서 37°C로 24시간 동안 반응시킨다.

• (5)

  샘플과 동일한 양의 chloroform–isoamylalcohol (24:1)을 첨가한 후, 10,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 시료의 층을 분리한다.

• (6)

  시료의 상층액을 새로운 1.7 mL 튜브로 분리한 후, 분리한 시료에 0.2 volume의 10 M ammonium acetate 그리고 0.5 volume의 isopropanol을 첨가한다.

• (7)

  14000 rpm으로 20분간 원심분리하여 eDNA를 침전시킨다.

• (8)

  eDNA 펠렛을 제외한 용액을 제거한 뒤 70% 에탄올 1 mL를 첨가하여 eDNA 펠렛을 세척한다.

• (9)

  eDNA 펠렛을 제외한 용액을 제거한 뒤 70% 에탄올 1 mL를 첨가하여 eDNA 펠렛을 세척한다.

• (10)

  1,4000 rpm으로 10분간 원심분리하여 eDNA를 침전시킨다.

• (11)

  eDNA 펠렛을 제외한 70% 에탄올 용액을 완전히 제거 및 건조시킨 후, eDNA를 1×TE 완충용액 100 μL로 희석한다.

나. eDNA 정량 및 품질 검증(QC)

본 단계는 추출된 DNA의 양과 질을 평가하여 다음 단계인 PCR 증폭의 성공률을 높이는 것을 목적으로 한다.

• (1)

  측정 장비: 미량 분광광도계(e.g., NanoDrop)를 권장한다.

• (2)

  측정 항목: 추출된 eDNA 용액의 농도(ng/µL)와 순도(A260/280, A260/230 비율)를 측정한다.

• (3)

  품질기준:

  • 순도 (A260/280): 1.8 ~ 2.0 범위를 양질의 DNA로 판단한다. (1.8 미만: 단백질 오염 가능성, 2.0 초과: RNA 오염 가능성)

  • 순도 (A260/230): 2.0 ~ 2.2 범위를 권장하며, 이보다 낮을 경우 PCR 반응을 저해하는 휴믹산(humic acids) 등의 억제물질 오염을 의심할 수 있다.

  • 오염 및 PCR 저해 반응이 예상되는 경우 1/10 희석하여 PCR 품질을 향상시킬 수 있다.

가. 차세대 염기서열 시퀀싱 및 데이터 생성

• (1)

  염기서열 분석:

  • MiSeq 플랫폼을 이용하여 차세대 염기서열 시퀀싱을 진행한다.

  • 양방향 서열분석(Paired-end, PE)을 수행한다.

• (2)

  데이터 생성:

  • 분석 완료 후, 각 샘플별로 정방향과 역방향 서열 정보를 담고있는 FASTQ 형식의 파일을 생성 및 보관한다.

나. 데이터 전처리 (어댑터, 낮은 품질의 염기 및 서열 제거)

본 단계는 분석의 정확도를 저해할 수 있는 어댑터 서열, 낮은 품질의 염기, 너무 짧은 서열 등을 제거하여 고품질의 순수 분석 데이터를 확보하는 것을 목적으로 한다.

• (1)

  Trimmomatic (v0.33) 소프트웨어를 사용해 PE LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:50:20 MINLEN:10 조건으로 분석을 수행한다.

  • LEADING:3, TRAILING:3 옵션은 서열의 시작과 끝에서 Phred 품질 점수가 3 미만인 염기를 제거한다.

  • SLIDINGWINDOW:50:20 옵션은 50 bp 크기의 윈도우를 이동시키며, 해당 구간의 평균 품질 점수가 20 미만으로 떨어지면 그 지점부터 서열의 끝까지 제거한다.

  • MINLEN:100 옵션은 모든 전처리 과정 후 최종 길이가 100 bp 미만인 서열은 분석에서 제외한다.

• (2)

  Cutadapt (v1.9.1) 소프트웨어를 사용해 -e 0.2 --overlap 15 --discard-untrimmed 조건으로 분석을 수행한다.

  • -e 0.2 옵션은 프라이머 서열과 최대 20%의 염기서열 불일치를 허용한다.

  • --overlap 15 옵션은 프라이머 서열과 최소 15 bp 이상 일치해야 제거 대상으로 인식한다.

  • --discard-untrimmed 옵션은 프라이머 서열이 성공적으로 제거되지 않은 리드는 분석에서 제외하여 정확도를 높인다.