수생태계 건강성 평가를 위한 미생물 메타지노믹스(Metagenomics) 가이드라인
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Step. 01
현장 수체시료 여과
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Step. 02
DNA 추출 및 정제
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Step. 03
라이브러리 제작
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Step. 04
염기서열 분석
(Sequencing)
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Step. 05
데이터 분석
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Step. 06
건강성 예측
현장 수체시료 여과
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(1)
표층수 채수
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(2)
25 µm 체로 부유물·모래 제거
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(3)
여과 : 0.22 µm S-Pak® mixed cellulose ester (MCE) membrane filter (Millipore) 사용
채수량은 현장의 탁도를 고려하여 조정 (100-500 mL) -
(4)
여과지는 튜브에 담아 드라이아이스에 고정
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(5)
시료는 드라이아이스가 있는 아이스박스로 운반하고 영하 80℃ 딥프리저에 보관
DNA 추출 및 정제
Use ChargeSwitch® Forensic DNA Purification Kit (InvitrogenTM)
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(1)
시료 용해(Lyse sample)
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(2)
DNA를 ChargeSwith® 자성 비드(magnetic beads)에 결합
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(3)
DNA가 결합된 비드를 세척하여 오염물 제거
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(4)
비드에서 DNA 용출
자세한 내용은 링크를 통해 참고하세요.
라이브러리 제작 (증폭 및 정제)
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(1)
Amplicon PCR (박테리아 16S rRNA V3-V4 영역)
341F: CCTACGGGNGGCWGCAG
805R: GACTACHVGGGTATCTAATCC -
(2)
PCR 정제
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(3)
Index PCR (FC‐131‐1001 or FC‐131‐1002)
Nextera XT Index 1 Primers (N7XX)
Nextera XT Index 2 Primers (S5XX) -
(4)
PCR 정제 2차
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(5)
라이브러리 정량화(quantification), 정규화(normalization), 그리고 풀링(pooling)
자세한 내용은 링크를 통해 참고하세요.
염기서열 분석(Sequencing)
Illumina MiSeq, 2×300 bp 플랫폼 이용
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(1)
라이브러리 검증
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(2)
라이브러리 변성(Denaturing)
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(3)
MiSeq 샘플 로딩
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(4)
Raw FASTQ (R1, R2) 확보
데이터 분석
1. DADA2 파이프라인
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(1)
FASTQ 파일의 리드(read) 품질 프로파일 검사
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(2)
필터링 및 트리밍
데이터에 따라 조정(R1: 270~290, R2: 210~240) -
(3)
오류율 학습
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(4)
양방향으로 읽은 리드 병합(겹침≥20–30 bp 권장)
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(5)
키메라(Chimera) 제거
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(6)
서열에 분류학적 정보 부여 (SILVA v138.1)
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(7)
결과 저장 및 병합
자세한 내용은 링크를 통해 참고하세요.
2. 노이즈 데이터 제거 (remove noise data)
3. 정규화 (Total sum scaling, 100%)
건강성 예측
1. 선별된 바이오마커 67개 균주에 대한 상대풍부도 값 정렬
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(1)
선별된 바이오마커 67개 균주(ASV)의 시퀀스와 매칭되는 데이터 정렬
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(2)
67개 균주의 상대풍부도 값으로 구성된 모델 및 테스트 데이터셋 확보
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마커정보는 링크를 통해 확인하세요.
2. 랜덤 포레스트(Random Forest) 예측 모델 구동
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(1)
패키지 설치 및 불러오기
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(2)
모델 데이터셋 불러오기
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(3)
데이터 증강
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(4)
훈련 및 테스트(Internal test) 데이터 분할
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(5)
하이퍼파라미터 튜닝 설정
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(6)
모델 학습
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(7)
테스트할 데이터셋 불러오기(External test)
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(8)
건강성 점수 예측
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(9)
건강성 점수를 등급으로 변환